自身免疫疾病和风湿免疫病诊断自身抗体标志物筛选计划

ADREAM（Autoimmune Disease and Rheumatic disease Early-diagnosis Autoantibody bioMarker Screening）Plan

  疾病标志物是疾病在生命微观世界的体现者，具有重要的临床诊断价值和基础研究价值。蛋白是基因和环境互作的直接体现者，蛋白标志物的发现和鉴定工作持续是检测领域的热点。博翀生物规划ADREAM项目，旨在为临床和基础医学专家提供“自身免疫疾病&风湿免疫疾病”蛋白标志物筛选和验证的整体科研服务。

  ADREAM项目基于HuProt™人类全蛋白质组芯片以及博翀生物成熟的蛋白质芯片技术服务平台和实践经验，以系统性筛选、发现、建立和验证各种免疫类疾病的血清学自身抗体或组合为方法学，建立基于大样本量具有统计学意义和临床应用价值的疾病血清学特异性自身抗体标志物。

1. 自身免疫疾病和风湿免疫疾病概述

  自身免疫疾病和风湿免疫疾病都是因免疫系统异常从而导致组织或功能异常的免疫类疾病（统称自免病），共同特点包括：

 （1）受累组织不同临床表现错综复杂；

 （2）病程缓慢迁延反复；

 （3）治疗可以使用激素免疫抑制剂缓解；

 （4）女性患病风险普遍比男性高，且部分疾病可以通过胎盘传递给胎儿；

 （5）病情复杂危害严重，给家庭和社会造成严重困扰；

 （6）自身免疫抗体是自免病最重要的特征^1-3，可以对自免病进行鉴别诊断，预警预防，病情评估治疗检测，病程转归预后判断。

  自免病发展快，病种多，误诊误治多，耽误最佳治疗时机。因此需加强自免病病免疫血清学诊断标志物的研发和推广，提高自免病诊断水平。

2. 自身抗体标志物研究方法介绍

  自身抗体标志物筛选方法本质上是抗原库的制备和免疫筛选方法的建立。目前文献报道的自身抗体标志物筛选的主要方法中（表1），蛋白组芯片Protein microarray筛选法是最直接和最高效的方法，其原理是利用高通量蛋白组作为抗原库进行疾病血清学自身抗体的筛选。

表1. 自免病自身抗体筛选方法文献实例部分汇总 

注：8号文献的样本组成包括2部分：白塞病自身抗体标志物发现阶段的检测样本+验证阶段的验证样本。

  其中，美国CDI Laboratory公司的HuProt™人类全蛋白质组芯片产品是一款拥有19394个蛋白覆盖蛋白组75%的最高通量的蛋白组芯片，正是用于疾病自身抗体标志物发现的理想工具（图2）^4,5，该款蛋白质芯片已应用于原发性胆汁性肝硬化⁶、神经精神性红斑狼疮⁷，白塞病⁸等自身免疫性疾病，以及胃癌⁹等恶性肿瘤的生物标志物发现。

图2. HuProt™蛋白芯片筛选自身抗体实验原理示意图。（A）HuProt™人类全蛋白质组芯片产品。（B）HuProt™人蛋白质组芯片作为抗原库直接进行血清学筛选实验流程。每个血清样本，使用1张HuProtTM蛋白质芯片进行检测，血清中的特异抗体（包括IgG和IgM，或其它亚型抗体）与固定于芯片上的蛋白进行结合，再用抗人IgM荧光标记二抗（cy5标记，呈现红色）和抗人IgG荧光二抗（cy3标记，呈现绿色）检测，进行血清中差异自身抗体的鉴定。

  2017年博翀生物利用HuProt™芯片开展10种肿瘤自身抗体标志物筛选的TEAMS项目，取得重大突破，并积累了大量的标志物整体实验服务和数据分析实践经验，为ADREAM计划的开展打下坚实的基础。

3. ADREAM项目

  根据自免病分类和蛋白组芯片筛选自身抗体标志物方案特点，博翀生物将ADREAM项目分为八大分支计划（图3），以ADREAM-风湿免疫疾病分支的标志物开发研究为例，该计划以所有的风湿免疫疾病（41种）为研究对象，重点覆盖弥漫系统性风湿免疫疾病的自身诊断标志物筛选。具体项目实施将以客户为中心进行开展，每一个分支项目都可以根据客户研究需求进行疾病联合和自身抗体标志物筛选。

图3. ADREAM项目八大分支：ADREAM-风湿免疫病、神经系统疾病、消化系统疾病、心血管系统疾病、呼吸系统疾病、皮肤性疾病、内分泌系统疾病和类自免病疾病。每个ADREAM分支都以相近类型疾病进行归类和联合分析，图示的每一个分支都只列举部分代表性的疾病，实际ADREAM计划以客户需求为中心进行自免病联合和标志物自身抗体的筛选和验证工作。

  ADREAM项目方案主要包括两个阶段：（1）第一阶段自免病标志物发现，（2）第二阶段大样本标志物验证。第一阶段各个疾病的标志物筛选实验单独同期进行；第二阶段标志物验证采用横向（健康对照）和纵向（联合的其它免疫病）验证获取自免病的特异标志物，此为特异性验证的关键点（图4）。以ADREAM-风湿免疫疾病分支的干燥综合症项目为例详细说明，如下：

  1）第一阶段标志物筛选（Discovery Phage）: 使用HuProt™人类全蛋白质组芯片进行初筛，以发现具有一定差异的潜在候选自身抗原，干燥综合症病组和健康对照组样本各15例，每3例样本进行混样芯片检测；该阶段联合的各个疾病项目单独同期进行。第一阶段完成后，干燥综合症和联合的自免病都获得各自的候选自身抗体池数据。

  2）联合疾病候选抗原蛋白小芯片（Focus AAg Array）制备：干燥综合症候选标志物抗原，联合疾病的候选标志物抗原，同时汇总文献中比较好的自身抗体抗原或客户感兴趣的蛋白，进行蛋白小芯片制备，每个小芯片可以检测验证12个样本。此阶段项目联合的每个疾病候选AAg集中点制在该蛋白小芯片上，因此小芯片制备需要第一阶段所有联合的疾病标志物初筛项目结束后进行。

  3）第二阶段大样本标志物验证（Validation Phase）: 每个疾病进行100例疾病标志物验证，100例健康对照，和100N（N为联合的疾病数）例联合疾病样本特异性验证。所有样本进行标志物检测验证之后，利用其数据建立疾病分辨模型，然后进行模型训练和评估。模型训练以获得能够区分健康对照、干燥综合症、其它风湿免疫病对照的特异性标志物组合以及模型。模型评估采用独立样本进行客观评价，最佳标志物组合数据进行独立的ROC曲线验证评价。

图4. ADREAM项目方案实施路线图。1）第一阶段标志物筛选: 使用HuProt™人类全蛋白质组芯片初步筛选具有一定差异的潜在自身抗原。2）联合的疾病候选标志物抗原进行蛋白小芯片（Focus AAg Array）制备。3）第二阶段大样本标志物验证: 每个疾病标志物进行100例疾病标志物验证，100例健康对照，和100N联合疾病样本特异性验证。

  博翀生物以ADREAM项目为契机，希望能够和自免病各个领域专家进行深度项目合作。ADREAM各个自免病项目可以单独进行，也可以联合其它自免病项目同步进行，且联合的项目越多数据特异性越强。同时博翀生物设置ADREAM项目联合开发共赢优惠服务措施和发文奖励计划，以保障ADREAM项目顺利开展实施。

  ADREAM计划每个项目获得的实验数据可支持发表高质量的学术文章1篇（表1-8）。另外，ADREAM项目产生的标志物可以申请2-5项发明专利（甚至进行商业转化），同时项目获得的标志物后续可进行一系列地临床和基础研究，发表一系列的科研成果进入良性临床科研循环。

  博翀生物ADREAM项目的实施将为自免病的诊断提供有价值的自身抗体标志物临床应用指标，为自免病自身抗体诊断提供检测行业规范指南和2030年健康中国做出我们的贡献。同时，自身抗体标志物的发现也能提供从抗原角度解析庞大免疫系统的基础科研视角，从而为研究各类疾病的基础研究和免疫治疗提供有价值的方向。

参考文献

1. Arbuckle, M. R. et al. (2003) Development of autoantibodies before the clinical onset of systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine 349, 1526-1533, doi:10.1056/NEJMoa021933.

2. Metcalf, J. V. et al. (1996) Natural history of early primary biliary cirrhosis. Lancet (London, England) 348, 1399-1402, doi:10.1016/s0140-6736(96)04410-8.

3. Majka, D. S. et al. (2008) Duration of preclinical rheumatoid arthritis-related autoantibody positivity increases in subjects with older age at time of disease diagnosis. Annals of the rheumatic diseases 67, 801-807, doi:10.1136/ard.2007.076679.

4. Hu, S. et al. (2007) A protein chip approach for high-throughput antigen identification and characterization. Proteomics 7, 2151-2161, doi:10.1002/pmic.200600923.

5. Jeong, J. S. et al. (2012) Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Molecular & cellular proteomics : MCP 11, O111 016253, doi:10.1074/mcp.O111.016253.

6. Hu, C. J. et al. (2012) Identification of new autoantigens for primary biliary cirrhosis using human proteome microarrays. Molecular & cellular proteomics : MCP 11, 669-680, doi:10.1074/mcp.M111.015529.

7. Hu, C. et al. (2015) Autoantibody profiling on human proteome microarray for biomarker discovery in cerebrospinal fluid and sera of neuropsychiatric lupus. PloS one 10, e0126643, doi:10.1371/journal.pone.0126643.

8. Hu, C. J. et al. (2017) Identification of Novel Biomarkers for Behcet Disease Diagnosis Using Human Proteome Microarray Approach. Molecular & cellular proteomics : MCP 16, 147-156, doi:10.1074/mcp.M116.061002.

9. Yang, L. et al. (2016) Identification of Serum Biomarkers for Gastric Cancer Diagnosis Using a Human Proteome Microarray. Molecular & cellular proteomics : MCP 15, 614-623, doi:10.1074/mcp.M115.051250.

自免病案例分享：

患者腹泻十几天，多器官衰竭，但我们还没弄清楚到底是什么病……