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【抗体特异性检测】基于HuProt蛋白芯片的高质量抗体生产标准流程
时间:2018-05-07 10:03:09

  抗体是基础科研和临床分析最常用的工具之一,但近年来科学家们发现越来越多通过抗体获得的高影响力研究成果无法被重现,这个“重现危机”迫切的需要建立一整套抗体验证标准,以评价抗体特异性、功能性和重复性这三个核心问题,这也是目前抗体产品最迫切需要解决的关键问题。

  2015年抗体公司巨头Termo Fisher率先与国际抗体验证工作组(IWGAV)展开合作,并于次年提出抗体特异性和功能性验证的5大策略:遗传策略,正交策略,独立的抗体验证策略,标签蛋白表达策略,生物策略。从而为高质量抗体产品行业规范迈出重要的一步。

  同期,美国NIH提出针对人转录因子蛋白进行抗体生产和验证标准化实践的试点项目PCRP(Protein Capture Reagents Program ),旨在建立标准化的高质量抗体生产流程。最近PCRP在《Nature Methods》杂志上阐述了关于最新PCRP管线生产高质量抗体的标准流程,该流程中最重要的抗体特异性评价是利用HuProt蛋白芯片实现单克隆抗体的海选和特异性验证。

蛋白芯片验证抗体特异性方法简介:

  利用蛋白芯片进行抗体特异性验证是目前抗体特异性评价的高效方法,通过抗体与蛋白芯片孵育杂交分析互作结合情况,从而全局性的评价目的抗体与蛋白组全部蛋白的交叉反应数据,最终评价抗体的特异性(图1)。


图1.蛋白芯片法验证商业抗体特异性。(AB)从1公司购买的PTEN抗体,能够特异的和蛋白芯片上的PTEN抗原互作;(CD)从2公司购买的PTEN抗体和蛋白芯片上的非靶蛋白存在较强的交叉互作反应,特异性较差。


PCRP管线进行抗体生产和验证标准流程:
  PCRP管线是一个单克隆抗体mAb生产和特异性验证的标准化流程,该流程基于HuProt蛋白芯片作为抗体特异性筛选和验证的工具为基础进行快速高效特异性单克隆抗体的评价,然后通过多种实验手段进一步功能验证最终获得高质量目标抗体(图2)。其特异性验证也适用于分析现有单克隆抗体的特异性检测。


图2. PCRP管线进行抗体生产和验证的标准流程。PCRP管线主要流程包括:(A)抗原生产;(B)杂交瘤细胞制备和抗体生产;(C)使用蛋白质芯片进行全局性的抗体特异性检测验证;(D)通过免疫沉淀(IP)、免疫印迹(IB)、免疫组化(IHC)和染色质免疫共沉淀(ChIP)进行抗体功能验证;(E)抗体杂交瘤细胞入库DSHB等并进行商业供应服务。


  研究人员利用该标准管线使用3599个小鼠产生122662个单克隆抗体,经过蛋白芯片特异性验证筛选到2016个单抗,然后进一步验证获得737个蛋白的1406个高特异性抗体(图3)。


图3. PCRP管线标准生产抗体的效率和质量。(A)PCRP管线生产抗体的成功率;(B)PCRP管线生产的抗体比商业化抗体具有更好的特异性;(C) PCRP管线生产的抗体经过最严格的免疫荧光敲除细胞系验证特异性。


蛋白芯片法检测抗体特异性方法简评:
  抗体特异性验证已经形成广泛共识,尤其发表高分文章需要提供抗体特异性的证据。为此,2018年初国内率先在上海举办首届《抗体验证大会》,凝聚抗体行业共识和规范。虽然,国际抗体验证工作组IWGAV提供5项验证抗体特异性的策略,但具体研究领域的抗体特异性验证至少需要一种策略进行抗体特异性验证。
  利用HuProt人类蛋白质组芯片可以全面检测抗体与全蛋白质组的交叉反应,以此评估其结合特异性,是一种高效简洁的抗体特异性验证方法,未来很有可能会发展成抗体质量检测和评估的标准性规范。本文针对人1314个转录因子的单克隆抗体进行蛋白芯片高通量特异性验证,最终获得737个转录因子高质量的单克隆抗体1406个,是对蛋白芯片法检测抗体特异性的最有力注释。博翀生物是一家专业提供蛋白质芯片产品和科研服务的高科技公司,我们也已开展利用HuProt芯片进行抗体特异性验证的科研服务,如您有抗体特异性验证的需求,博翀生物愿真诚为您服务。


参考文献:
Venkataraman A, et al., (2018) A toolbox of immunoprecipitation-grade monoclonal antibodies to human transcription factors. [J]. Nature Methods.
Blackshaw S, et al., (2016) The NIH Protein Capture Reagents Program (PCRP): a standardized protein affinity reagent toolbox. [J]. Nature Methods.
Jeong JS, et al., (2012) Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. [J]. Mol Cell Proteomics.

博翀生物HuProt人全蛋白质组芯片产品:
•全球最高通量的人蛋白质组芯片
•包含总蛋白数近20000个蛋白基因数(81%覆盖度)
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应用:
•血清标志物和新免疫原的发现
•病原菌-宿主相互作用机制研究
•蛋白质-蛋白质相互作用
•蛋白质-DNA/RNA相互作用
•蛋白质-小分子相互作用
•蛋白质翻译后修饰研究
•抗体特异性快速检测

博翀生物期待和您在抗体特异性检测等领域进行深度合作,欢迎来电来函咨询。
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