儿童肺炎可由多种微生物引起，如病毒、细菌、支原体和衣原体，而由不同病因引起的肺炎则有不同的治疗策略。近年来支原体肺炎的发病率逐渐增加，但临床医生由于缺乏足够的诊断方法，不能有效区分细菌性肺炎和非细菌性肺炎，从而无法对症下药，全球每年约有200万儿童死于肺炎。因此，寻求鉴定新的生物标志物，用于非细菌性肺炎和细菌性肺炎之间的鉴别诊断是必不可少的。

华盈生物的张庆华博士以社区获得性肺炎（CAP）为研究对象，通过使用博翀生物的凝集素芯片，结合质谱，分析不同病因引起肺炎的儿童患者的血清样品，并通过Western blot分析评估，最终找到儿童非细菌性肺炎血清诊断的潜在生物标志物HPR，该研究成果近期在《Proteomics-Clinical Applications》杂志上发表。

思路解析

1）儿童血清样本收集

2）凝集素芯片筛选血清样本确定候选标志物

3）Lectin blot分析验证芯片结果

4）Pull down和LC-MS/MS进行糖蛋白验证

5）Western blot分析确定潜在标志物

研究结果

1）样本收集

    该研究中的所有受试者均为在上海儿童医学中心接受社区获得性肺炎（CAP）住院治疗的儿童，采集血清样本并且将样品储存在-80℃直至使用。对于凝集素芯片筛选，支原体肺炎组、细菌性肺炎组和正常儿童各设组6组；进一步的Western blot验证实验中，细菌性肺炎、支原体肺炎和正常组各设置21组，病毒性肺炎设置19组。所有样品信息如表1所示。

表1. 样本设置

2）凝集素芯片筛选血清样本确定候选标志物

研究人员利用凝集素芯片对支原体肺炎患儿（n = 6），细菌性肺炎患儿（n = 6）和正常儿童（n = 6）的血清样品进行分析。芯片结果如图1所示，有4种凝集素（CALSEPA、MIA、PAA 、SNA-I）在不同组间的结合信号有明显差异。 

图1. 凝集素芯片分析血清样品

（A）凝集素芯片的布局和代表性分析结果（右下部分）；（B）四种凝集素（CALSEPA，MIA，PAA和SNA-1）在不同组间的结合信号差异。（* p <0.05和** p <0.01； M，支原体肺炎；B，细菌性肺炎； NC，正常对照）

3）Lectin blot分析验证芯片结果

研究人员选取SNA-I进行lectin blot实验，对芯片筛选结果进行验证。如图2（A）所示，支原体肺炎组检测信号明显高于正常对照组和细菌性肺炎组；对考马斯蓝染色的42 kDa条带附近进行信号强度分析，如图2（B）所示，支原体肺炎组SNA-I的分子量在42 kDa附近强烈增加，而且其含量与结合信号具有高度相关性。据此，研究人员推测，支原体肺炎患儿中SNA-I的结合信号增加可能是由于42 kDa附近蛋白的表达量升高。

图2. Lectin blot分析凝集素芯片筛选结果

（A）不同组间血清的SNA-I印迹42 kDa信号强度分析（M，支原体肺炎；B，细菌性肺炎； NC，正常对照）；（B）考马斯亮蓝染色 42 kDa条带附近信号强度分析；（C）信号强度相关性分析，** p <0.01和*** p <0.001。

4）Pull down、LC-MS/MS和Western blot确定潜在标志物

通过凝集素印迹分析，接近42 kDa的条带是考马斯亮蓝染色最多的条带（图3 A，用红色箭头表示），这表明蛋白质与SNA-I有强烈的相互作用。切下该条带用于LC-MS / MS鉴定，获得了18种潜在的SNA-I结合糖蛋白，其中两种高度同源的蛋白质（高达91％的相似性）HP和HPR含量最多。

为了进一步分析潜在的生物标志物，研究人员对来自SNA-I样品的两种蛋白质进行了Western blot分析，发现M组在42 kDa左右的蛋白是HPR（图3 B）。随后进行大样本的血清验证，细菌性肺炎、支原体肺炎和正常组各设置21组，病毒性肺炎设置19组。相对定量结果显示，与细菌性肺炎组相比HPR在支原体肺炎组和病毒性肺炎组中均升高（图3 C）。与正常组相比，所有肺炎组的HPR均升高（图3 D）。证实了支原体肺炎患儿中SNA-I的结合信号增加是由于HPR的表达升高。 

图3. Pull down和Western blot验证

（A）来自SNA-1提取的蛋白质（P-M3）和全血清（M3）的考马斯亮蓝染色。 在P-M3泳道（红色箭头）的42 kDa附近出现强染色条带，挖取该条带打质谱；（B）通过Western blot验证鉴定的蛋白质HP和HPR；（C）和（D）不同组之间的HPR印迹信号强度的比较。 * p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001。 M，支原体肺炎;；B，细菌性肺炎；V，病毒性肺炎；N，正常组；P，肺炎组。

参考文献

Yang, L, et al. Lectin Microarray Combined with Mass Spectrometry IdentifiesHaptoglobin-Related Protein (HPR) as a Potential Serologic Biomarker forSeparating Nonbacterial Pneumonia from Bacterial Pneumonia in Childhood [J]. Proteomics Clin Appl, 2018, e1800030.

凝集素（lectin）是自然界广泛存在具有特异识别和结合特定糖链的蛋白质，被广泛应用于糖基化修饰研究。凝集素芯片是研究动物、植物、细菌、真菌细胞或蛋白高通量检测糖基化修饰的高效工具。细胞表面糖复合物中糖链结构的异常变化往往和癌症等疾病的发生有密切的关系，凝集素芯片可以系统性高通量的研究糖链差异或变化，是解析细胞膜表面糖链信息的理想工具。

博翀生物凝集素芯片介绍

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