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【Huprot蛋白芯片】弓形虫激酶ROP18靶向的关键宿主蛋白的筛选
时间:2018-07-27 09:03:21
 

弓形虫是一种广泛分布的病原体寄生虫,可在先天性感染的新生儿和免疫功能低下的个体中引起严重的弓形虫病。该疾病在临床管理方面取得了一定的进展,但仍存在重要的局限性。因此,发现针对弓形虫病的新靶标和有效治疗策略是非常重要的。

中山大学周兴旺教授团队与约翰·霍普金斯大学朱衡教授利用人蛋白质组芯片,筛选出多种弓形虫毒力激酶ROP18作用的宿主靶蛋白,并对其进行了生物学验证。研究证明ROP18靶向p53p38UBE2NSmad1进行降解,并且首次证明ROP18通过磷酸化Smad1 Ser187促进其降解。该研究成果在《Molecular& Cellular Proteomics》上在线发表。

研究人员使用HuProt芯片系统地鉴定ROP18的底物,将纯化带有GST标签的ROP18Δ83ROP18Δ83-KD(无激酶活性的D394A突变体)蛋白分别与含有通用激酶反应缓冲液的HuProt芯片一起孵育,检测HuProt芯片上的磷酸化信号,阈值设定为2.5时,分析鉴定出ROP18激酶的68个潜在底物。

 

1. 使用HuProt芯片鉴定ROP18激酶底物

AGST标记的ROP18构建体GST-ROP18Δ83GST-ROP18Δ83-KD的示意图;BHuProt芯片鉴定ROP18激酶底物的总体方案; CHuProt芯片的代表性图像;DX射线胶片的代表性照片。

 

针对ROP1868个体外底物,进行了STRING分析和 GO分析,发现ROP18底物富含几种特异性信号传导途径。随后在PhosphoNetworks数据库中对ROP18289种人激酶的底物相似性进行比较,发现14种人激酶在底物特异性方面与ROP18显示出显着的相似性(p <0.01)。

 

2. ROP18的体外底物进行生物信息学分析

A.ROP18磷酸化多种激酶(上图),ROP18通过靶向MAPKKKMAP3K5)、p38MAPK11)和JNK2 / 3MAPK9MAPK10)来调节两条平行的MAPK信号传导途径(下图);B. PhosphoNetworks数据库分析ROP18与人激酶的底物相似性。

  

基于前期的研究以及生物信息学分析结果,研究人员认为ROP18可能在抗凋亡中起重要作用。后续的实验中选择p53p38UBE2NSmad1做进一步的细胞学实验验证,结果证明ROP18激酶作用的新的宿主靶蛋白为p53p38UBE2NSmad1,该研究还发现ROP18可通过磷酸化Smad1 187位丝氨酸促进其特异降解。

 

3. 细胞水平验证ROP18的宿主蛋白

A/C/E: ROP18Δ83的过表达显着降低了p53p38UBE2N的蛋白质水平;B/D/F: 野生型(WTRHROP18-Ty1 RH菌株感染293T细胞. WT RH菌株和ROP18-Ty1 RH菌株的感染均导致p53p38UBE2N蛋白的降解,ROP18-Ty1 RH菌株更显著;G: ROP18Δ83的表达以剂量依赖性方式显着降低Smad1的蛋白水平,在蛋白酶体抑制剂MG132存在下Smad1的蛋白水平恢复(M1S187AS195AS206AS214A; M2S187AS195AS206A; M3S206A; M4S187AH: ROP18磷酸化Smad1 Ser-187以促进其蛋白降解。

 

参考文献

Yang Z, et al. A Human Proteome Array Approach to Identifying Key Host Proteins Targeted by Toxoplasma Kinase ROP18 [J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2017, 16(3):469.

目前常用酵母双杂交检测ROP18的底物,该方法使用具有一定局限性,无法检测蛋白质生物活性。HuprotTM蛋白质芯片包含20,240个人重组蛋白质,是迄今为止通量最高的人类蛋白质组芯片,已应用于泛素化,乙酰化和S-亚硝基化修饰的蛋白质的全局分析以及识别激酶底物,是蛋白质组学研究的强大工具。

 

HuProt™ 人类全蛋白质组芯片

 

 广州博翀生物科技有限公司是一家专业提供蛋白质芯片,凝集素芯片,药物小分子芯片等产品和定制服务的高科技公司。公司成立于2009年,为中国科学院生物物理研究所成果转化的标杆企业,专注于蛋白芯片技术和产品。

 
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