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人诱导多能干细胞产生的细胞外囊泡的糖谱分析
时间:2018-12-12 08:41:35
 

细胞外囊泡(extracellular vesiclesEV)是纳米和微米尺寸的膜囊泡,在细胞传递信号期间充当蛋白质、脂质和核酸的载体,是细胞间通讯的重要介质。细胞外囊泡含有丰富的生物标志物,可用于监测临床状态、治疗反应和疾病进展等,在临床医学中有十分光明的应用前景。

日本Hiroaki Tateno教授研究团队使用凝集素芯片分析了源自人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells hiPSCs)的细胞外囊泡(extracellular vesiclesEV)的糖组分,发现hiPSC衍生的EV的聚糖谱与非hiPSC衍生的EV的聚糖谱不同,证明rBC2LCN可用于hiPSC衍生的EV的特异性检测,并指出EV糖谱是用于再生医学的干细胞的鉴定和表征的新靶标。相关研究结果在《Scientific Reports 》在线发表。

 



凝集素芯片分析hiPSCs来源的EV

从人诱导多功能干细胞(201B7)、人脂肪来源的间充质干细胞(ADSC#2117#2118)、人类软骨细胞(Yub621c, Yub625)和人类纤维细胞(hfibs)中纯化出EVS,并用Cy3标记后与凝集素微芯片进行孵育,对芯片荧光强度进行无监督聚类分析,结果如图1A所示,Hipsc来源的EV与非Hipsc来源的EV在聚糖上有很大的差异。

hiPSCs的细胞表面糖组分析显示,重组凝集素rBC2LCNhiPSC来源的EV有特异性结合,但与非hiPSC来源的EV无特异性结合(2B,左图) 另外,α2-6Sia结合的凝集素如SNA,与非hipsc来源的EV相比,显示出对hiPSC来源的EV更强的结合(图2B,右图)。这些结果表明,hiPSC衍生的EV保留了在hiPSC上表达的聚糖结构的特征。

 

1. 凝集素芯片对纯化后的EVs进行分析

A)凝集素芯片信号无监督聚类分析(黄色:高信号、黑色:中等信号、蓝色:低信号);(B) rBC2LCN(左)和SNA(右)对细胞疏水部分和EVs的结合强度信号图。

 


流氏细胞术分析


通过流式细胞术分析了hiPSC标志物(rBC2LCN配体,SSEA4TRA-1-60)EV上的表达。利用外泌体标记抗体(抗CD9和抗CD63)可以检测到Tim4固定化珠捕获的EV,且抗CD9hiPSC来源的EV的结合力比抗CD63的强(2A)。流式细胞术检测发现rBC2LCNhiPSCs以及hiPSC来源的EV有很强的结合(2A)。其他hiPSC标记抗体(如抗TRA-1-60,抗SSEA4和抗R-10G)虽然也与EV和细胞结合但是它们的荧光信号强度明显弱于rBC2LCN。实验结果表明EVshiPSC标记物的表达与细胞表面的表达呈正相关,说明EVs上的聚糖可以反映细胞表面聚糖的表达(2B)

 

 

2. 流式细胞分析

(A) 外泌体标志物(CD 9CD 63)和hiPSC标志物(rBC2lcnT-1-60SSEA 4R-10gpodocalycin)在EV和细胞上的表达;(B)EV和细胞上标志物表达量之间的相互关系。

 


hiPSC来源EVsrBC2LCN糖蛋白配体的发现


如图3A所示,在hiPSCs亲水性组分和EV中都能检测到在约240kda强而弥散的蛋白条带,而之前的报道中,HPSCs亲水性组分中rBC2LCN染色的高分子量蛋白带被鉴定为足细胞标记蛋白,因此推测hiPSC来源EVrBC2LCN染色的高分子量条带也可能有足细胞标记蛋白。对此猜想进行验证,IP实验结果如图3B所示,与rBC2LCN固定化磁珠共沉淀的糖蛋白在与抗足细胞标记蛋白(pAb)杂交后,在240kDa显示弥漫性蛋白条带,这些结果表明足细胞标记蛋白是rBC2LCN的糖蛋白配体。

 

 

3.足细胞标记蛋白是rBC2LCN的糖蛋白配体

 


夹心法检测hiPSC来源的EV


鉴于hiPSC来源的EV上可以表达hiPSC标志物(如rBC2LCN配体等),研究人员对rBC2LCN是否可以用于检测hiPSC来源的EV及其检测能力进行评估,如图4A所示,Tim4-rBC2LCN夹心法可以检测hiPSC来源的EVs且具有高特异性和高敏感性。

此外,研究人员还检测了内皮分化过程中hiPSC来源的EV,如图4C所示,Tim4-CD63夹心试验检测到的EV总量与细胞数量成正比,与细胞分化状态无关。而Tim4-rBC2LCN夹心实验中,EV在分化第3天表现出最高,随后显著下降。这些数据表明,Tim4-rBC2LCN夹心实验可特异性检测hiPSC衍生的EV

 

 

4. 夹心法检测hiPSC来源的EVs

ATim4-rBC2LCN夹心法检测hiPSC来源的EVs的具有高特异性和敏感性;(BTim4-rBC2LCN夹心法检测内皮分化过程中EVs


小结:

糖基化是主要的翻译后修饰,细胞表面聚糖结构在发育、细胞活化、分化和恶性转化过程中会有显著改变,高通量的凝集素芯片是用于细胞表面糖基化分析的强有力工具。

参考文献:

Saito S, et al., Glycome analysis of extracellular vesicles derived from human induced pluripotent stem cells using lectin microarray [J]. Scientific Reports, 2018, 8(1):3997

 

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