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细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）是纳米和微米尺寸的膜囊泡，在细胞传递信号期间充当蛋白质、脂质和核酸的载体，是细胞间通讯的重要介质。细胞外囊泡含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态、治疗反应和疾病进展等，在临床医学中有十分光明的应用前景。
日本Hiroaki Tateno教授研究团队使用凝集素芯片分析了源自人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells ，hiPSCs）的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）的糖组分，发现hiPSC衍生的EV的聚糖谱与非hiPSC衍生的EV的聚糖谱不同，证明rBC2LCN可用于hiPSC衍生的EV的特异性检测，并指出EV糖谱是用于再生医学的干细胞的鉴定和表征的新靶标。相关研究结果在《Scientific Reports 》在线发表。
凝集素芯片分析
hiPSCs来源的EV从人诱导多功能干细胞（201B7）、人脂肪来源的间充质干细胞（ADSC#2117，#2118）、人类软骨细胞（Yub621c, Yub625）和人类纤维细胞（hfibs）中纯化出EVS，并用Cy3标记后与凝集素微芯片进行孵育，对芯片荧光强度进行无监督聚类分析，结果如图1A所示，Hipsc来源的EV与非Hipsc来源的EV在聚糖上有很大的差异。
hiPSCs的细胞表面糖组分析显示，重组凝集素rBC2LCN与hiPSC来源的EV有特异性结合，但与非hiPSC来源的EV无特异性结合(图2B，左图)。 另外，α2-6Sia结合的凝集素如SNA，与非hipsc来源的EV相比，显示出对hiPSC来源的EV更强的结合（图2B，右图）。这些结果表明，hiPSC衍生的EV保留了在hiPSC上表达的聚糖结构的特征。
图1. 凝集素芯片对纯化后的EVs进行分析
（A）凝集素芯片信号无监督聚类分析（黄色：高信号、黑色：中等信号、蓝色：低信号）；(B) rBC2LCN（左）和SNA（右）对细胞疏水部分和EVs的结合强度信号图。
流氏细胞术分析
通过流式细胞术分析了hiPSC标志物(rBC2LCN配体，SSEA4和TRA-1-60)在EV上的表达。利用外泌体标记抗体（抗CD9和抗CD63）可以检测到Tim4固定化珠捕获的EV，且抗CD9对hiPSC来源的EV的结合力比抗CD63的强(图2A)。流式细胞术检测发现rBC2LCN与hiPSCs以及hiPSC来源的EV有很强的结合(图2A)。其他hiPSC标记抗体(如抗TRA-1-60，抗SSEA4和抗R-10G)虽然也与EV和细胞结合但是它们的荧光信号强度明显弱于rBC2LCN。实验结果表明EVs上hiPSC标记物的表达与细胞表面的表达呈正相关，说明EVs上的聚糖可以反映细胞表面聚糖的表达(图2B)。
图2. 流式细胞分析
(A) 外泌体标志物（CD 9和CD 63）和hiPSC标志物（rBC2lcn，T-1-60，SSEA 4，R-10g，podocalycin）在EV和细胞上的表达；(B)EV和细胞上标志物表达量之间的相互关系。
hiPSC来源EVs上rBC2LCN糖蛋白配体的发现
如图3A所示，在hiPSCs亲水性组分和EV中都能检测到在约240kda强而弥散的蛋白条带，而之前的报道中，HPSCs亲水性组分中rBC2LCN染色的高分子量蛋白带被鉴定为足细胞标记蛋白，因此推测hiPSC来源EV中rBC2LCN染色的高分子量条带也可能有足细胞标记蛋白。对此猜想进行验证，IP实验结果如图3B所示，与rBC2LCN固定化磁珠共沉淀的糖蛋白在与抗足细胞标记蛋白(pAb)杂交后，在约240kDa处显示弥漫性蛋白条带，这些结果表明足细胞标记蛋白是rBC2LCN的糖蛋白配体。
图3.足细胞标记蛋白是rBC2LCN的糖蛋白配体
夹心法检测hiPSC来源的EV
鉴于hiPSC来源的EV上可以表达hiPSC标志物（如rBC2LCN配体等），研究人员对rBC2LCN是否可以用于检测hiPSC来源的EV及其检测能力进行评估，如图4A所示，Tim4-rBC2LCN夹心法可以检测hiPSC来源的EVs且具有高特异性和高敏感性。
此外，研究人员还检测了内皮分化过程中hiPSC来源的EV，如图4C所示，Tim4-抗CD63夹心试验检测到的EV总量与细胞数量成正比，与细胞分化状态无关。而Tim4-rBC2LCN夹心实验中，EV在分化第3天表现出最高，随后显著下降。这些数据表明，Tim4-rBC2LCN夹心实验可特异性检测hiPSC衍生的EV。
图4. 夹心法检测hiPSC来源的EVs
（A）Tim4-rBC2LCN夹心法检测hiPSC来源的EVs的具有高特异性和敏感性；（B）Tim4-rBC2LCN夹心法检测内皮分化过程中EVs。
小结：
糖基化是主要的翻译后修饰，细胞表面聚糖结构在发育、细胞活化、分化和恶性转化过程中会有显著改变，高通量的凝集素芯片是用于细胞表面糖基化分析的强有力工具。
参考文献：
Saito S, et al., Glycome analysis of extracellular vesicles derived from human induced pluripotent stem cells using lectin microarray [J]. Scientific Reports, 2018, 8(1):3997
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