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三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。TNBC与其他类型乳腺癌相比，预后较差，死亡风险较高，治疗手段以化疗为主。临床迫切需求发现新的分子靶点，开发低毒性的药物来治疗TNBC患者。
近期，温州医科大学教授团队与温州医科大学第一附属医院合作，对osthole在TNBC细胞中的作用进行研究。研究表明osthole可以通过结合STAT3抑制TNBC细胞的生长并促进其凋亡，为潜在治疗TNBC的新药物提供支持，STAT3有可能成为新型抗TNBC药物开发的靶点。相关研究结果在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》（IF=6.2）发表。
1. Osthole对TNBC细胞的影响
已有报道指出，osthole在人类的癌症中具有抑癌作用。为了研究osthole在乳腺癌细胞中是否具有类似的作用，研究人员对osthole处理下TNBC细胞的生存能力和生长情况进行评估。发现在osthole处理下，TNBC细胞的存活率降低，而且TNBC细胞中MDM2, Cyclin B1和 CDC2的表达水平下降，这表明osthole可抑制TNBC细胞的生长，促进TNBC细胞活的凋亡并引起细胞周期阻滞。
图1. Osthole抑制TNBC细胞的生长
（A）Osthole对人TNBC细胞活力的影响；（B）osthole处理下后TNBC细胞凋亡检测；（C）MDA-MB-231和BT-549细胞分别用osthole处理48h和24h后，WB检测凋亡相关蛋白；（D）采用PI染色和流式细胞术检测TNBC细胞周期阻滞的诱导作用；（E）MDA - MB - 231和BT - 549细胞用200μM osthole 处理36 h和18 h，WB检测G2/M细胞周期相关蛋白MDM-2、Cyclin B1、CDC2水平。
2. Huprot蛋白芯片筛选潜在结合靶点
为了确定osthole抑制乳腺癌的机制和靶点，研究人员利用高通量的蛋白质组学研究工具---Huprot人蛋白质组芯片，对osthole的结合蛋白进行筛选，发现了199个与osthole结合的蛋白。对这些蛋白进行生物学分析，研究人员发现在这些蛋白中，STAT3在多种恶性肿瘤中被异常激活且其可促进癌细胞的凋亡。因此，研究人员推测STAT3可能是osthole在TNBC细胞中产生抑制作用的潜在靶蛋白。
图2. Huprot蛋白芯片筛选osthole结合蛋白
（A）生物素标记osthole；（B）生物素化osthole活性测定；（C）芯片反应模式图；（D）芯片反应荧光图；（E）放大后STAT3蛋白斑点图。
3. Osthole对STAT3的活性影响
研究人员评估了STAT3在TNBC细胞中的活性，研究表明在MDA-MB-231和BT-549细胞系(图4 A和B)中 STAT3磷酸化水平(p-STAT3) 是高基底的，细胞暴露在osthole下会减少p-STAT3的水平，但并不是时间和剂量依赖性，这些发现表明osthole可能通过直接结合STAT3而抑制其活性。
Western blot检测发现osthole以剂量依赖性的方式抑制IL-6诱导的p-STAT3(图4c)。此外，从细胞中提取的核提取物显示，暴露于IL-6和osthole的MDA-MB-231细胞中，细胞核STAT3水平降低(图4e)。这些结果表明，osthole能有效地阻止STAT3的活化和核易位。
图3. Osthole抑制TNBC细胞中STAT3的磷酸化
（A） MDA - MB - 231和BT - 549细胞在200 μM osthole处理下的P-STAT3水平测定；（B）MDA-MB-231和BT- 549细胞在不同浓度osthole 处理24小时和12小时的P-STAT3水平测定；（C）细胞在200 μM osthole 处理24 h(MDA - MB - 231)或12 h(BT - 549)后用IL-6 (50 ng/mL)刺激30分钟，WB检测STAT3磷酸化情况；（D）细胞免疫荧光染色显示MDA-MB-231细胞中P-STAT3(红色)的分布；（E）MDA-MB-231细胞经osthole预处理24 h后暴露于IL-6 (50 ng/mL) 30 min，核提取物经WB检测P-STAT3和STAT3。
4. 过表达STAT3
在MDA-MB-231细胞中过表达STAT3，增加STAT3的磷酸化水平，结果显示过表达STAT3可以逆转osthole诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞，这说明在TNBC细胞中osthole的抑制作用是通过抑制STAT3发挥功能的。
图4. 过表达STAT3可降低MDA-MB-231细胞中osthoper介导的细胞毒性作用
（A）转染STAT3质粒后MDA-MB-231细胞中STAT3和P-STAT3水平；（B）STAT3蛋白水平的定量；（C）STAT3 过表达细胞和空载转染细胞，暴露在200 μM osthole 48 h，流式细胞术检测凋亡细胞；（D）凋亡细胞百分比定量分析；（E）STAT3过表达细胞和空载转染细胞，暴露在200 μM osthole 36 h，流式细胞术测定G2/M细胞周期 (* P < 0.05)。
5. 动物实验验证
为了确认在体内osthole是否可以抑制TNBC的生长以及这种抑制作用是否与STAT3有关，研究人员在裸鼠中使用MDA-MB-231乳腺癌细胞进行异种抑制并进行相关研究。结果表明，osthole可通过抑制STAT3有效抑制肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞。
图5. Osthole在体内抑制MDA-MB-231异种移植生长
（A）Osthole治疗组小鼠和对照组肿瘤体积比较；（B）第48天切除的肿瘤组织比较；（C）第48天肿瘤重量测定；（D）WB检测切除肿瘤标本的P-STAT3水平；（E）肿瘤切片免疫组化染色。
小结：
该研究确定了Osthole对TNBC细胞的抗肿瘤活性以及其潜在的机制，证明Osthole可作为治疗TNBC新的候选方案，而STAT3可能是新型抗TNBC药物开发的靶点。
参考文献：
Dai X , et al., Osthole inhibits triple negative breast cancer cells by suppressing STAT3[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2018.
博翀生物HuProt蛋白芯片介绍：
