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细菌蛋白芯片与人蛋白芯片联合使用,鉴定病原与宿主相互作用
时间:2019-02-15 11:20:39

细菌性脑膜炎是新生儿和儿童死亡和发病的重要原因,几乎所有对人类有致病性的微生物都有可能引起脑膜炎,但少数细菌,如大肠杆菌,占了急性细菌性脑膜炎的大多数病例。然而病原体利用血脑屏障的潜在分子机制尚不完全清楚。

为了确定大肠杆菌与血脑屏障细胞相互作用的重要参与者,美国约翰霍普金斯大学朱衡教授研究团队利用了大肠杆菌和人类蛋白质芯片,证实了YojIIFNAR2同介导细菌和宿主细胞相互作用。相关研究在《Anal Chem 在线发表。


 

研究思路及方案

1. 大肠杆菌蛋白芯片筛选病原蛋白

2. FACS验证候选病原蛋白

3. HuProt人蛋白芯片筛选与病原相互作用的宿主受体蛋白

4. 候选宿主蛋白验证

 

1. 实验思路流程图

 



 

1大肠杆菌蛋白质组芯片筛选HBMEC相互作用的大肠杆菌蛋白

研究人脑微血管内皮细胞HBMEC蛋白与大肠杆菌的结合,对HBMEC进行标记,利用大肠杆菌蛋白质组芯片进行检测,芯片扫描仪采集蛋白芯片的结合信号。进行数据分析,获得23个候选结合蛋白,其中有8个被标记为膜蛋白(DgkAGIpFPpxPstCYbaESapCYojIYgdD)。GIpFPstCYbaESapCYojI都编码转运体活性而对YojIYbaE的功能之前未见有研究,所以选择它们进行进一步研究。

为了验证HBMEC与候选蛋白的相互作用,采用流氏细胞术进行分析。在测试中,YojIYbaE显示出与HBMEC结合具有剂量依赖性 (2A−C),表明YojIYbaE可能会与HBMEC相互作用。以前的一些研究也提示YojI可能参与介导大肠杆菌和HBMEC之间的结合。

 

2. HBMEC与候选蛋白的相互作用

AFACS检测YojIYbaEHBMEC相互作用的阈值;(BHBMEC与不同浓度的YojI结合信号检测;(CHBMEC与不同浓度的YbaE结合信号检测。

 



 

2. YojIHBMEC相互作用的验证

为了分析YojIHBMEC的相互作用,研究人员进行了一系列的实验。首先是HBMEC结合YojI偶联荧光微球的分析(图3A),结果显示YojI偶联荧光微球组的信号强度明显高于对照组;然后还通过细胞粘附试验检测了HBMECYojI/YojI 敲除菌株的相互作用(图3B),结果显示YojI 敲除细胞与HBMEC的结合显著低于WT;此外还采用竞争性实验验证YojI在宿主细胞识别中的特异性(图3C)。这些实验结果均表明YojI在大肠杆菌和HBMEC的相互作用中起着重要的作用。

由于病原菌附着于血脑屏障可引起局部炎症,因此研究人员推断如果YojI在大肠杆菌附着于宿主血脑屏障细胞中发挥关键作用,那么YojI蛋白与HBMEC的相互作用就可能会影响已知参与炎症的基因转录。相关研究也表明YojI提高了NR4A1NLRP2的表达水平,进一步间接证明了YojI可能在宿主细胞识别中发挥重要作用。

 

3. YojIHBMEC的相互作用验证

AYojI偶联荧光微球与HBMEC结合实验;(B)细胞粘附试验检测HBMECYojI/YojI  菌株的相互作用;(CYojI蛋白的存在降低大肠杆菌和HBMEC的相互作用。

 



 

3HuProt人蛋白芯片鉴定YojI的潜在宿主受体

研究人员采用HuProt人蛋白芯片,鉴定大肠杆菌蛋白YojI所识别的宿主受体。将纯化的YojI蛋白进行标记并与HuProt人蛋白芯片进行孵育,检测荧光信号,获得候选结合蛋白。在这些候选蛋白中有5种膜蛋白IFNAR2IL10RANRP1SIGLEC7MC4R,其中IFNAR2YojI的结合信号最强(F/B:3.60)。因此,研究人员也更关注YojIIFNAR2相互作用的进一步表征。

 

4. HuProt人蛋白芯片鉴定YojI的潜在宿主受体

F:前台中值信号;B:背景中值信号;F/B:前背景比中位数

 



 

4. YojIIFNAR2共同介导细菌和宿主细胞相互左右

为了评估IFNAR2在细菌-宿主相互作用中的作用,研究人员通过细胞实验来评估不同条件下大肠杆菌细胞对HBMEC的结合效率。通过粘附试验和菌落计数发现,当敲除HBMEC细胞中的IFNAR2时 (5A)附着效率有一个小但显著的减少(89%)(5A),而当YojI也被敲除时,附着效率显著降低至33%的最低水平,说明IFNAR2YojI之间存在叠加效应。

为了证明IFNAR2介导的细胞与宿主细胞相互作用的特异性,研究人员用不同浓度的抗IFNAR2抗体阻断HBMEC(5B),观察到大肠杆菌的附着效率随着抗体浓度的增加而逐渐降低,这表明IFNAR2在介导细菌-宿主细胞相互作用中发挥作用。

 

5. YojIIFNAR2介导的大肠杆菌与宿主细胞相互作用的验证

A)与未处理的细胞相比,HBMECIFNAR2 (shRNA1)的敲除显著降低了WT大肠杆菌对HBMEC的粘附;(B)大肠杆菌和HBMEC的相互作用依赖于IFNAR2*表示P<0.05**表示 P < 0.01

 



 

小结:

        本文研究通过利用现有的大肠杆菌蛋白芯片和人蛋白芯片,快速识别病原和宿主的重要参与者。随着蛋白质芯片的不断发展,这种研究方法将在识别控制病原体与宿主相互作用的重要参与者方面具有指导意义。

Feng Y, et al., High-Throughput Chip Assay for Investigating Escherichia coli Interaction with the Blood-Brain Barrier Using Microbial and Human Proteome Microarrays (Dual-Microarray Technology). Anal Chem [J], 2018, seq 18,90(18):10958-10966.

 


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大肠杆菌蛋白芯片简介

HuProt人蛋白芯片简介

 

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