克山病糖生物标志物筛选

时间：2019-03-25 14:34:38

糖基化是分泌蛋白翻译后最常见的修饰之一，在细胞间的相互作用、细胞黏附、恶性转化和转移中起重要作用。

今天为大家分享一篇利用凝集素芯片对CKD患者、LKD患者和正常人的血液和唾液进行分析，研究糖蛋白在慢性和潜伏性克山病(CKD和LKD)发病机制中作用的文献。该研究结果在《Molecules》在线发表。

 研究思路：

1.      LKD、CKD和健康样本收集；

2.      疾病唾液标志物初筛；

3.      疾病血液标志物初筛

4.      唾液标志物验证；

5.      血液标志物验证。

样本设置：

 

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1.  凝集素芯片分析男性唾液

选取10例男性LKD、10例男性CKD组和12例男性健康对照的唾液样本进行凝集素芯片实验，结果显示LKD组和健康对照组有10种凝集素具有显著性差异。其中LKD组的STL、WGA与对照组相比信号较强，而PHA-E +L、PTL-I、LTL、PSA、AAL、ConA、Jacalin、GSL-II与对照组相比信号较弱(图1 )。

对CKD组和LKD组进行了比较，发现两组之间有16种凝集素荧光强度存在显著差异。与LKD组相比，CKD组中AAL、ECA、PTL-I、PNA、WFA、BS-I、SJA、Jacalin和PHA-E+L的信号较强，而SBA、PSA、WGA、VVA、MAL-I、ConA和ACA信号较弱(图1)。

 

图1. 男性唾液糖蛋白的糖基化模式

 

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 2. 凝集素芯片分析女性唾液

选取10例女性LKD组、10例女性CKD组和12例女性健康对照的唾液样本进行凝集素芯片实验，结果显示女性CKD组和健康对照组有10种凝集素具有显著性差异。与健康对照相比，CKD组中GSL-I、RCA120、GNA和SNA的信号较高，而PTL-I、PHA-E+L、PTL-II、AAL、LTL、HHL信号较弱。

LKD组和健康对照组有8种凝集素具有显著性差异，与正常对照组相比，LKD组中STL、GSL-I、RCA120信号水平较高，而SBA、PSA、PTL-II、WGA和LTL信号较弱 (图2)。

比较CKD组和LKD组，发现CKD组中MAL-I 和WGA的荧光强调明显高于LKD组。(图2)

 

 

图2.女性唾液糖蛋白的糖基化模式

(a) 女性CKD、LKD患者和正常对照者唾液中cy3标记的唾液蛋白与凝集素芯片结合的情况，染色强度差异显著的凝集素用白色框框标记；(b)比较三组间凝集素结合水平。条形图表示从凝集素的三个复制点测量的平均+SD。

 

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 3. 凝集素芯片分析男性血液

对男性CKD组、LKD组和健康对照组的血清样本进行凝集素芯片反应，结果显示LKD组男性血清与正常对照组之间的凝集素差异较小，而CKD组和正常对照组中共有17种凝集素的荧光强度存在显著变化、CKD组和LKD组有14种凝集素荧光强度有显著差异(图3)。这表明有些凝集素可能有助于鉴别男性CKD和LKD。

  

 

图3. 男性血清糖蛋白糖基化模式

 (a) 男性CKD、LKD患者和正常对照者血液中cy3标记的蛋白与凝集素芯片结合的情况。染色强度差异显著的凝集素用白色框框标记；(b) 比较三组间凝集素结合水平。条形图表示从凝集素的三个复制点测量的平均+SD。

 

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 4. 凝集素芯片分析女性血液

对女性CKD组、LKD组和健康组的血清进行凝集素芯片分析(图4)，结果显示女性CKD血清与正常对照组相比有14种凝集素具有显著性差异、女性LKD组血清与正常对照组相比与正常对照组相比有7种凝集素具有显著性差异、女性CKD组和LKD组血清相比有15种凝集素具有显著性差异。

 

 

图4. 女性血清糖蛋白糖基化模式

(a) 女性CKD、LKD患者和正常对照者血液中cy3标记的蛋白与凝集素芯片结合的情况。染色强度差异显著的凝集素用白色框框标记；(b) 比较三组间凝集素结合水平。条形图表示从凝集素的三个复制点测量的平均+SD。

 

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5.  唾液标志物验证

基于前期唾液样本凝集素芯片筛选及数据分析结果，选择了6种凝集素作为唾液标志物进行验证（男性唾液标志物3种，PSA、STL、WGA；女性唾液标志物3种，RCA、PHA-E+L、MAL-1）。男性唾液样本芯片结果显示，与健康组相比，CKD组的PSA和WGA信号较弱，而STL的信号较强； LKD组的 PSA信号较弱，WGA和STL的信号较强 (图5)，这表明STL可作为男性CKD和LKD的诊断生物标志物，而WGA可作为区分这两个阶段的标志物。

 

图5.候选标志物验证

(a)唾液微阵列上cy3标记凝集素的扫描图像；(b)从唾液微阵列中获得的六组数据的盒状图分析；(c)唾液芯片获得的6组数据的散点图分析。（CK-M: CKD男性患者，LK-M: LKD男性患者，H- m:正常对照组男性患者，CK-F: CKD女性患者，LK-F: LKD女性患者）

 

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小结：

本研究利用凝集素芯片作为研究平台，从唾液和血液以及性别等方面对克山病的诊断标志物进行研究，寻找糖蛋白糖基化模式的变化，发现STL可作为是男性CKD和LKD的诊断生物标志物，WGA可能有助于区分这两个阶段。

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    参考文献：

Sen W , et al,. Roles of Glycoproteins in the Diagnosis and Differential Diagnosis of Chronic and Latent Keshan Disease[J]. Molecules, 2017, 22(5):746.

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