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凝集素芯片分析甲型流感病毒的宿主细胞特异性糖基谱
时间:2019-04-24 15:43:05
    甲型流感病毒(IAV)属于甲型流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae),IAV的病毒粒子被宿主细胞来源的包膜和三种病毒蛋白所覆盖。其中HA是包膜上的主要蛋白,以宿主体液免疫为靶点,而HA聚糖的结构可能会因宿主细胞或其内部环境而变化。为了更好地了解聚糖对病毒发病机制的生物学意义,直接分析人类或动物样本是关键。
     
 近期有研究通过免疫沉淀富集抗原,利用凝集素芯片技术分析并获得HA糖谱,该方法不需要释放或纯化聚糖分子,甚至不需要其他复杂的制备过程,为病毒糖蛋白的糖基谱分析提供了一种高灵敏度、简便易行的方法,为直接分析人和动物源病毒粒子的糖基谱奠定了基础。相关研究结果在《Virology》在线发表。  
 
 
1.凝集素芯片分析
        研究人员用甲型流感病毒A/PR/8/34株(H1N1)和A/Aichi/2/68(H3N2)感染鸡胚,然后收集感染性尿囊液,将所有灭活的感染性尿囊液稀释后用抗HA单克隆抗体免疫沉淀病毒抗原,成功地富集了HA、NP、M等病毒抗原,并用部分免疫沉淀样品进行凝集素芯片分析(图1A)。
        凝集素芯片结果显示PR/8/34 (H1N1)和Aichi/2/68 (H3N2)感染的样本之间糖基谱差异不大,但岩藻糖的凝集素(AOL、AAL)、LacNAc (RCA120、PHA-E、 DSA)和高甘露糖N -聚糖(NPA、GNA、HHL))都产生了高信号强度(图1B和C)。除此之外,LEL、WFA和WGA也表现出高信号,这可能是由于LacNAc终止的N-聚糖的交叉反应。

图1.凝集素芯片反应
(A)实验流程示意图。将福尔马林灭活病毒溶液稀释至106 TCID50的效价,用抗HA单克隆抗体免疫沉淀病毒抗原,用凝集素芯片对抗原进行分析;(B)PR/8/34(H1N1)感染样本的凝集素芯片分析典型结果图;(C)Aichi/2/68 (H3N2) 感染样本的凝集素芯片分析典型结果图。



 

2. PR/8/34 (H1N1) HA宿主细胞特异性糖基化谱
        为了研究甲型流感HA宿主细胞特异性糖基化谱,研究人员从MDCK、Vero和A549细胞的感染上清中制备了PR/8/34 (H1N1)的富集抗原。然后用凝集素芯片对每个样品进行分析。结果表明MDCK细胞制备的HA在凝集素芯片上的糖基谱上显示出独特的模式(图2)。

 


图2. PR/8/34(H1N1) HA宿主细胞特异性糖基化分析
从MDCK (A)、Vero (B)或A549细胞(C)中提取PR/8/34 (H1N1)病毒HA,并利用凝集素芯片分析糖基谱。数据表示为三个点标准差(SD)的均值信号。



 

3. PR/8/34 (H1N1)感染MDCK细胞糖基蛋白的变化        

        由于MDCK细胞制备的HA在凝集素芯片上显示出独特的糖基谱模式,研究人员进一步分析了感染PR/8/34 (H1N1)的MDCK细胞的糖基谱的变化。对芯片结果进行均一化处理后发现(图3A),感染后细胞样本的ECA、RCA120、AOL、AAL和EEL表现出高信号强度,SNA、SSA、TJA-I表现出弱信号强度,其中EEL是MDCK衍生HA的特定凝集素。
        采用EEL和抗HA单克隆抗体对感染PR/8/34 (H1N1)的MDCK细胞进行免疫荧光染色(图3B);随后,制备PR/ 8/34 (H1N1)感染MDCK细胞的全细胞裂解液,进行基于EEL的凝集素印迹分析(图3C),在PR/8/34 (H1N1)感染样本中检测到约50 kDa的强强度条带, EEL免疫印迹结果表明这种EEL阳性糖蛋白就是病毒HA(图3D)。这些结果表明,在感染PR/8/34 (H1N1)病毒时,与EEL识别相关的糖基变化最先出现。

图3.PR/8/34 (H1N1)感染MDCK细胞糖基蛋白的变化
(A)PR/8/34 (H1N1)感染的MDCK细胞裂解液的糖基谱;(B)PR/8/34 (H1N1)感染MDCK细胞的免疫荧光和凝集素染色;(C)PR/8/34 (H1N1)感染MDCK细胞并进行银染 (左)和EEL免疫印迹 (右);(D)EEL凝集素印迹实验。


 
小结:
        本研究利用凝集素芯片技术建立了一种高灵敏度、简便的甲型流感HA糖基分析方法,该方法能够对不同宿主细胞中制备的IAVs HA的糖基进行比较分析,结合基于MS的分析应该有助于更好地理解聚糖在病毒发病中的意义。
参考文献:
Hiono T, et al., Lectin microarray analyses reveal host cell-specific glycan profiles of the hemagglutinins of influenza A viruses[J]. Virology, 2019, 527:132-140.
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