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临床上针对结核病和慢性肺损伤的有效诊断手段仍然缺乏，对于结核病诊断和潜伏性结核病感染（LTBI）筛查也需要新的技术和新的生物标志物。佛山第四人民医院研究团队采用细胞因子抗体芯片检测细胞因子谱及其在结核病感染后的动态变化，筛选并检测血清细胞因子作为结核病诊断的潜在生物标志物。结果表明细胞因子I-309和MIG、IL-8、Extoxin-2、ICAM-1以及IFN-γ/IL-4、IL-2/TNF-a等多种细胞因子的组合可作为LTBI和活动性结核病筛查的血清生物标志物。
样本选择
收集54名受试者的96份血清样本做细胞因子抗体芯片筛选，其中有12名健康对照组(N组)、21名LTBI患者(I组)和21名活动性结核病患者(Pa组、Pb组和Pc组)。收集240名受试者的血清样本做ELISA验证实验(80名健康对照组、80名结核病患者和80名慢性肺炎、肺癌或其他肺部疾病患者) 。
表1.样本信息表
细胞因子表达谱检测
为了筛选LTBI和活动性结核的血清细胞因子生物标志物,研究人员收集了健康对照组(N)、LTB感染(I)、活动性结核病患者(Pa:新诊断的患者) 和不同的化疗时间点的活动性结核病患者(Pb: 2个月化疗，Pc: 6个月化疗后治愈病患)的血清样本，并用细胞因子抗体芯片来检测细胞因子表达谱（图1)。对信号强度进行提取、归一化，然后进行热图分析，结果显示细胞因子表达谱在各组间存在显著差异(图1B)。芯片结果显示，不仅与结核病感染相关的IFN-g、IL-2、TNF-a、IL-4等细胞因子在不同组间存在显著的改变，其他与结核病免疫学和病理学无关的细胞因子(MIG、IL-8和I-309)也出现了显著变化。
图1. 血清细胞因子表达谱检测
a 细胞因子抗体芯片分析血清细胞因子表达谱，健康对照组(N，n=12), LTB感染(I，n=21),活动性结核病患者在三个不同的阶段 (每个阶段n=21)化疗后与人类细胞因子数组。
b 热图分析显示各组细胞因子谱存在显著差异。
抗原刺激下细胞因子检测
研究人员用TB特异性抗原(ESAT-6和CFP-10)与健康对照组、LTBI患者和活动性结核病患者的全血样本进行孵育，来证明结核病感染时淋巴细胞释放出I-309、IL-8和MIG。结果表明这三种细胞因子在活动性结核病患者血液样本中的表达均明显高于LTBI患者和健康对照组(活动性结核病>LTBI>健康对照组)。
与PBS相比，所有样本组在TB抗原刺激下I-309的表达相对稳稳定定(图2A)，IL-8的表达均显著上调(图2B)；而MIG在LTBI和活动性结核病患者中的表达明显较高，在健康对照组中表达量低(图2C)。
研究人员还持续观察细胞因子对抗结核化疗的反应。共18种细胞因子在三组中 (Pa、Pb和Pc) 的任意两组之间表现出差异，多种细胞因子在抗结核化疗过程中逐渐减少(图2D)，其中MIG在三组间的差异具有统计学意义(p < 0.05)。
图2.MTB抗原刺激下细胞因子检测
A/B/C.在活动性结核病中，Mtb抗原(ESAT-6和CFP-10)可刺激I-309、IL-8和MIG的过表达；D.化疗2个月后I-309、IL-8表达下调，6个月后恢复。E.化疗后16种细胞因子逐渐下调。
活动性结核病细胞因子生物标志物鉴定
根据芯片的热图分析，研究人员发现IL-8、MIG和I-309三种细胞因子在活动性结核病患者中的表达谱存在显著差异(图3A)。通过ELISA实验对芯片结果进行验证，结果表明与健康对照组和其他肺部疾病患者相比，活动性肺结核患者的I-309和IL-8表达上调(图3D和E)，而MIG在活动性肺结核患者和非肺结核性肺病患者血清中均上调(图3C)。
通过ROC分析比较这三种细胞因子及其组合在活动性结核病诊断中的价值。AUCs分别为0.87 (MIG)、0.75 (I-309)、0.72 (IL-8)和0.88(组合)。
图3. 活动性肺结核患者血清中I-309、IL-8、MIG检测
A. 活动性结核病患者与非活动性结核病患者的表达谱差异分析；B. ROC曲线分析；C-E: ELISA实验验证。
此外热图分析结果显示，LTBI组和健康对照组中Eotaxin-2、ICAM-1、MIG的表达谱有显著差异(图4A)。研究人员采用ELISA检测进行验证，结果表明与健康对照组和其他肺部疾病患者相比，Eotaxin-2在LTBI感染患者血清中表达上调(图4C)，而ICAM-1在LTBI感染和非结核性肺病患者血清中均显著上调(图4D)。ROC曲线分析显示，在LTBI诊断中，AUCs分别为0.67 (Eotaxin-2)、0.59 (MIG)、0.52 (ICAM-1)和0.65 (组合)。
图4. LTBI患者血清中Eotaxin-2、ICAM-1、MIG检测
A.LTBI与健康对照的细胞因子表达谱差异分析；B.ROC曲线分析；C-D: ELISA实验验证。
小结
这项研究系统地比较了健康对照者、LTBI和活跃结核病患者的细胞因子表达谱，以确定结核病感染和抗结核化疗的细胞因子生物标志物；同时还发现在抗结核化疗过程中，细胞因子表达模式也在不断发生变化。
参考文献
Chen T,et al,.Profiling the human immune response to Mycobacterium tuberculosis by human cytokine array[J]. Tuberculosis, 2016, 97:108-117.
博翀生物可提供本研究中抗体芯片实验及ELISA验证实验
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