近期，约翰霍普金斯大学朱衡教授团队开发了病毒粒子显示(VirD)技术，使单通道和多通道膜蛋白可以在单纯性疱疹病毒-1（HSV-1）的包膜上正确定位和构象，并制备含315个GPCRs的VirD-GPCRs芯片。相关研究结果在《NATURE COMMUNICATIONS》发表。

VirD-GPCR阵列的制备

    为了开发第一个高含量的VirD阵列，我们决定专注于无气味的370个GPCRs，收集开放阅读框(ORFs)，将这些GPCR ORFs中去除终止密码子后，将它们亚克隆到BAC载体上HSV-1基因组的UL27位点，并在其c端与V5标记融合，成功地将335个GPCR ORFs亚克隆到UL27位点。将已证实的重组病毒构建物分别转染到Vero细胞中，转染后7天收集病毒。用抗v5单克隆抗体检测GPCRs的表达，共制备317株病毒的GPCRs，最终成功地制备了一个高含量的VirD阵列，覆盖了85%的带注释的无气味人类GPCRs。

    用抗gd抗体检测VirD-GPCR芯片的质量，315个VirD-GPCR与阴性对照(如BSA)相比，均表现出明显的抗gd信号。此外，重复进行的抗gd试验的散点图分析表明，该芯片具有较高的重现性，相关系数为0.92。

图1 VirD-GPCR芯片构建

a 335个人GPCR ORFs亚克隆到HSV-1基因组的UL27位点；

b VirD-GRCP制备和VirD芯片制作。

    为了证明VirD-GPCR芯片可用于检测抗体特异性，研究人员选择了20个以人GPCRs为靶点的商品化单克隆抗体。在这些测试的单克隆抗体中，只有9个能特异性识别目标，另一个anti-ACKR3能与CALCR和GPR61发生交叉反应，其余10个抗体检测结果为非特异性。

表1.VirD-GPCR芯片的特异性检测

GPCR活性的功能检测

    研究人员采用成像方法测试10个未被各自单克隆抗体识别的GPCRs与标准配体的结合活性，将未被识别的VirD-GPCRs分别固定在套片上，用TIRF显微镜记录荧光标记配体的结合信号，同时以K082病毒粒子作为阴性对照。

    结果显示除P2RY13外，其余9个VirD-GPCRs的结合信号均明显高于K082对照组，说明它们功能正常，折叠正确。这表明VirD GPCR芯片是筛选高质量单克隆抗体的一个强大的平台。

图2 TIRF分析VirD-GPCRs的配体结合

GPCR配体特异性试验

     研究人员选择了两种肽配体（dynorphin a和somatostatin-14 (SRIF-14)）来测试用VirD-GPCR芯片检测GPCR配体的结合特异性。如图3中所示,dynorphin A与其典型受体OPRD1结合，SRIF-14与超过15个的VirD-GPCRs结合(图3b)，包括其已知的受体SSTR2。

    为了确定观察到的SRIF-14的离靶点结合活性，研究人员采用细胞竞争实验检测了SRIF-14与随机选择的三个靶点GPCRs（GABBR2、NTSR1和KISS1R）之间的结合特异性 (图3c)。定量分析表明，与感染SSTR2的细胞相比，感染三种脱靶GPCRs的细胞系，结合信号都明显高于k082感染的细胞(图3d)。

图3 肽配体GPCR相互作用的鉴定与验证

a / b VirD-GPCR芯片反应；c Vero细胞分别感染SSTR2、GABBR2、NTSR1、KISS1R或K082病毒；d 结合信号的定量分析。

    无乳链球菌(又称B组链球菌或GBS)是通过穿透人血脑屏障(BBBs)而引起新生儿脑膜炎的最常见的革兰氏阳性菌。为了探索GBS可能利用宿主GPCRs作为穿透BBB的手段，研究人员采用cy3标记的GBS临床株K79 (一株脑膜炎新生儿分离的菌株)与VirD GPCR芯片进行了重复检测。结果表明5个VirD-GPCRs（GPR101、GPR148、LHCGR、CysLTR1和LGR5）对K79的结合信号明显高于对照组且具有重现性(图4a)，进一步实验验证CysLTR1可作为GBS潜在靶点。

图4 新型GBS GPCR受体的发现

a VirD-GPCRs芯片反应；b CysLTR1的体外验证；c CysLTR1的体内验证。

   本研究建立了在HSV-1脂质包膜上展示膜蛋白的方法，充分利用VirD技术，构建了一个由315个人类GPCRs组成的GPCR芯片。利用这种VirD-GPCR芯片作为工具，能够表征商业抗体和标准配体的特异性，并识别新的受体与宿主病原体的相互作用。

参考文献

Guan-Da Syu,et al,. Development and application of a high-content virion display human GPCR array[J]NATURE COMMUNICATIONS,2019,10:1997.