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人GPCR芯片的研制
时间:2019-07-26 10:22:17


    近期,约翰霍普金斯大学朱衡教授团队开发了病毒粒子显示(VirD)技术,使单通道和多通道膜蛋白可以在单纯性疱疹病毒-1(HSV-1)的包膜上正确定位和构象,并制备含315个GPCRs的VirD-GPCRs芯片。相关研究结果在《NATURE COMMUNICATIONS》发表。


VirD-GPCR阵列的制备

    为了开发第一个高含量的VirD阵列,我们决定专注于无气味的370个GPCRs,收集开放阅读框(ORFs),将这些GPCR ORFs中去除终止密码子后,将它们亚克隆到BAC载体上HSV-1基因组的UL27位点,并在其c端与V5标记融合,成功地将335个GPCR ORFs亚克隆到UL27位点。将已证实的重组病毒构建物分别转染到Vero细胞中,转染后7天收集病毒。用抗v5单克隆抗体检测GPCRs的表达,共制备317株病毒的GPCRs,最终成功地制备了一个高含量的VirD阵列,覆盖了85%的带注释的无气味人类GPCRs。

    用抗gd抗体检测VirD-GPCR芯片的质量,315个VirD-GPCR与阴性对照(如BSA)相比,均表现出明显的抗gd信号。此外,重复进行的抗gd试验的散点图分析表明,该芯片具有较高的重现性,相关系数为0.92。




图1 VirD-GPCR芯片构建

a 335个人GPCR ORFs亚克隆到HSV-1基因组的UL27位点;

b VirD-GRCP制备和VirD芯片制作。


VirD-GPCR芯片抗体特异性分析

    为了证明VirD-GPCR芯片可用于检测抗体特异性,研究人员选择了20个以人GPCRs为靶点的商品化单克隆抗体。在这些测试的单克隆抗体中,只有9个能特异性识别目标,另一个anti-ACKR3能与CALCR和GPR61发生交叉反应,其余10个抗体检测结果为非特异性


表1.VirD-GPCR芯片的特异性检测




GPCR活性的功能检测

    研究人员采用成像方法测试10个未被各自单克隆抗体识别的GPCRs与标准配体的结合活性,将未被识别的VirD-GPCRs分别固定在套片上,用TIRF显微镜记录荧光标记配体的结合信号,同时以K082病毒粒子作为阴性对照。

    结果显示除P2RY13外,其余9个VirD-GPCRs的结合信号均明显高于K082对照组,说明它们功能正常,折叠正确。这表明VirD GPCR芯片是筛选高质量单克隆抗体的一个强大的平台。


图2 TIRF分析VirD-GPCRs的配体结合



GPCR配体特异性试验

     研究人员选择了两种肽配体(dynorphin a和somatostatin-14 (SRIF-14))来测试用VirD-GPCR芯片检测GPCR配体的结合特异性。如图3中所示,dynorphin A与其典型受体OPRD1结合,SRIF-14与超过15个的VirD-GPCRs结合(图3b),包括其已知的受体SSTR2。

    为了确定观察到的SRIF-14的离靶点结合活性,研究人员采用细胞竞争实验检测了SRIF-14与随机选择的三个靶点GPCRs(GABBR2、NTSR1和KISS1R)之间的结合特异性 (图3c)。定量分析表明,与感染SSTR2的细胞相比,感染三种脱靶GPCRs的细胞系,结合信号都明显高于k082感染的细胞(图3d)。



图3 肽配体GPCR相互作用的鉴定与验证

a / b VirD-GPCR芯片反应;c Vero细胞分别感染SSTR2、GABBR2、NTSR1、KISS1R或K082病毒;d 结合信号的定量分析。


无乳链球菌的GPCR靶标的发现

    无乳链球菌(又称B组链球菌或GBS)是通过穿透人血脑屏障(BBBs)而引起新生儿脑膜炎的最常见的革兰氏阳性菌。为了探索GBS可能利用宿主GPCRs作为穿透BBB的手段,研究人员采用cy3标记的GBS临床株K79 (一株脑膜炎新生儿分离的菌株)与VirD GPCR芯片进行了重复检测。结果表明5个VirD-GPCRs(GPR101、GPR148、LHCGR、CysLTR1和LGR5)对K79的结合信号明显高于对照组且具有重现性(图4a),进一步实验验证CysLTR1可作为GBS潜在靶点。



图4 新型GBS GPCR受体的发现

a VirD-GPCRs芯片反应;b CysLTR1的体外验证;c CysLTR1的体内验证。


   本研究建立了在HSV-1脂质包膜上展示膜蛋白的方法,充分利用VirD技术,构建了一个由315个人类GPCRs组成的GPCR芯片。利用这种VirD-GPCR芯片作为工具,能够表征商业抗体和标准配体的特异性,并识别新的受体与宿主病原体的相互作用。


参考文献

Guan-Da Syu,et al,. Development and application of a high-content virion display human GPCR array[J]NATURE COMMUNICATIONS,2019,10:1997.

 

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