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概述：
肝细胞癌（HCC）是一个全球性的疾病，每年新增病人数超过70万，死亡率居恶行肿瘤第二。甲胎蛋白（AFP）是HCC早期诊断中经典的标志物，而由于其低灵敏度导致的假阴性问题较为普遍，因此临床上需要更有效的早诊标志物。但是，在新的标志物筛选中，常常面临着两个问题，第一，系统性、全局性不够；第二，精准度不够，即从海量的原始数据无法精准定位某一个或几个靶标分子。
为解决上述问题，近日，复旦大学附属中山医院肝癌研究所高强团队基于Huprot人类全蛋白质组芯片系统性、全局性的筛选HCC早期诊断标志物，通过集成逻辑回归（logistics regression）、人工神经网络（Artificial Neural Network）算法建立了针对HCC的精准区分模型，模型中包含了CIAPIN1，EGFR，MAS1，SLC44A3，ASAH1，UBL7和ZNF428这7种蛋白质，最后通过独立样本对模型的泛化能力进行验证。该研究在《Journal of Hematology & Oncology》在线发表(IF=11.059)。
研究思路：
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
该研究包括三个阶段：Discovery Phase（I）、Test Phase（II）、Validation Phase（III）。
蛋白芯片筛选潜在标志物
在discovery阶段（I），基于人类全蛋白质组芯片（芯片包括>20,000新测序的重组人源蛋白，覆盖率81%，是目前世界上通量最高的蛋白质芯片）筛选出HCC血清中的特异性免疫高响应的自身抗体（AAb），共计筛选出81个（图A）；在test阶段（II），联合相关文献报道的19个蛋白（共计100个），制备成肝癌特异的小芯片，并通过样本测试重复性，结果显示测试阵列呈现高重现性（图B）；用制备的小芯片进行大样本量测试，展示HCC患者、肝硬化患者、健康对照各一例的信号强度的三维渲染（图C）。
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
ANN（人工神经网络）模型建立
在Test阶段（II），基于定制芯片测试结果，分别比较分析HCC与Cirrhotic、HCC与healthy数据，并基于p-value <0.05，fold change≥1.2，sensitivity>15％，specificity>90％判定标准，筛选出55个潜在的生物标志物。
为了更加精准筛选出具备显著区分能力的单个或多个标志物，基于逻辑回归（logistics regression）算法对55种潜在的生物标志物进行进一步筛选，并通过10-fold cross validation（图A）筛选出7个蛋白，分别为CIAPIN1，EGFR，MAS1，SLC44A3，ASAH1，UBL7和ZNF428。
基于筛选出的标志物，通过神经网络中error BackPropagation算法建立多个人工神经网络(ANN)模型，并将模型进行集成，对肝细胞、肝癌患者和其他对照样本进行区分。在项目研究中建立的人工神经网络为全连接前馈神经网络，网络分为三层，输入层为7个神经元，隐含层为5个神经元，输出层为2个神经元，激活函数和输出函数均为sigmod函数（图C）。其中，所建立的7-AAb panel的ANN模型的sensitivity=68.6％，specificity=92.1％，AUC=0.894（HCC VS对照[健康+肝硬化]），优于AFP（临界值=400mg/mL，sensitivity=28.4％，specificity=98.7％，AUC =0.808）。
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
ANN（人工神经网络）模型验证
在validation阶段(III)，577例样本(279例肝细胞肝癌, 179例正常, 119例肝硬化患者)作为独立样本，通过盲测法对模型进行验证；在盲测过程中，通过训练产生的模型委员对每例样本进行投票，确定是否肝癌患者，最后通过临床确诊信息来确定模型的准确度。
ANN模型的工作流程图
（Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.）
对于建立的ANN模型，通过独立样本验证其泛化能力。验证结果中，sensitivity=68.6％，specificity= 90.1％，AUC=0.902（HCC VS对照[健康+肝硬化]）（表1），并且对于AFP阴性患者，即AFP指标无法检出的患者，ANN模型的sensitivity =80.6％，specificity 90.1％，AUC=0.926（AFP- HCC VS对照[健康+肝硬化]）（表2）。综合，ANN模型的灵敏度（62.2-77.5％），优于AFP（30.7％）。
当结合阶段（II）和阶段（III）的数据时，整体sensitivity=71.6％，specificity=90.0％,AUC=0.898（HCC VS对照组[健康+肝硬化]）（表2），对于AFP阴性患者，整体sensitivity=76.1％，specificity =89.1％，AUC=0.912（AFP-HCC与对照组[健康+肝硬化]）（表2）。
表1. 在HCC检测中评估7-AAb panel和AFP
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
表2. 在AFP- HCC检测中评估7-AAb panel
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
ANN模型应用
乙型肝炎表面抗原（HBsAg）可用于确定患者是近期还是长期感染HBV。实验中，大约70％的HCC患者为HBsAg+。对于HBsAg+-HCC检测，该模型提供了59.6-79.1％的灵敏度和85.2-95.5％的特异性（AUC =0.822~0.932），而AFP（临界值400mg/mL）提供了31.4-34.7％的灵敏度和96.7-100％的特异性。说明ANN模型能够有效地检测出HBsAg--HCC患者。
小结：
在本研究中，Huprot人类全蛋白质组芯片和定制芯片的应用，为标志物的筛选提供了系统性和全局性的解决方案，而人工神经网络（ANN）算法能从海量的原始数据中精准定位相关的靶标分子，为筛选出肝癌相关标志物组合提供新思路。
博翀生物可提供相关芯片实验服务及人工神经网络（ANN）算法。
参考文献
[1]Shu Zhang,et al. Autoantibody signature in hepatocellular carcinoma using seromics. Journal of Hematology & Oncology.2020.
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